FITC Bøyning Protokoller

Fluoresceinisotiocyanat, ofte referert til som FITC - uttales "passe-c," for å rime med "ditsy" - er en fluoriserende markør som er kjemisk bundet eller konjugert til andre molekyler, slik som proteiner og antistoffer. Et antistoff konjugert med FITC kan også bli referert til som en "FITC-merket antistoff." FITC eksiteres av lys med en bølgelengde på 488 nm og avgir fluoriserende energi detektert ved 530 nm. En vitenskapsmann kan se det med et fluorescerende mikroskop eller bruk utstyr som registrerer fluorescerende utslipp og registrerer dem.

metoder

FITC konjugering følger en grunnleggende protokollen. For eksempel vil FITC og et antistoff blandes sammen i et visst forhold i et reagensrør og rotert ved romtemperatur i en time. For å fjerne ubundet FITC fra oppløsningen, helles den på en affinitetskromatografikolonne - et glassrør fylt med en vulst-lignende gel som vil binde det ukonjugerte FITC. Samtidig vil FITC-merket antistoff som strømmer gjennom kolonnen og samles for bruk.

betraktninger

Før du starter en konjugering, bør forskeren vurdere flere punkter. For det første er FITC meget ustabil og bør ikke utsettes for lys - den bør holdes i rør folie-dekket til enhver tid. For det andre kan det hende at konjugering tid og temperatur må endres for en temperaturfølsom protein. Endelig kan forskjellige proteiner og antistoffer har forskjellige FITC-bindingskapasitet, så finne riktig forhold av antistoff til FITC er kritisk; for lite FITC gjør et antistoff umulig å oppdage og for mye kan endre sin spesifisitet. Av denne grunn bør foreløpige småskala bøyning ved forskjellige forhold mellom FITC til antistoffet bli satt opp i parallell. Når det optimale forholdet er etablert, kan den store konjugering utføres.

Bruker

Leger og forskere bruker FITC-merkede antistoffer, hormoner og vekstfaktorer i en rekke forskjellige analyser og applikasjoner. For eksempel kan en stamcelle som finnes i blodet har en molekyl på overflaten kalt CD34. En laboratorietekniker kan blande en pasients blod med en FITC-merket antistoff som er spesifikt for CD34, og kjøre cellene gjennom et strømningscytometer som benytter en laserstråle for å gjøre den FITC fluorescerer. Deretter skiller cytometeret de fluorescerende CD34 celler fra resten av blodceller, og legene kan bruke disse isolerte stamceller for terapeutiske behandlinger.